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Iso-Seq
Iso-Seq Iso-Seq
第三代 RNA 定序 Iso-Seq (isoform sequencing)，採用 PacBio HiFi 長片段定序技術，可獲得轉錄產物 (transcript) 從 3’ polyA 尾端至 5‘ 端的全長序列。無須經過組裝，即可呈現高品質的全長轉錄體序列，進而得到全轉錄體或基因組註釋，可應用於偵測轉錄異構體 (isoform)、融合基因 (fusion gene) 等。
將已純化之 RNA，使用 TSO (template switch oligo) 進行轉錄全長 cDNA 並建立 SMRTbell 文庫，然後以 PacBio Revio Platform 進行全長轉錄體定序與後續分析。
樣品條件
| RNA 檢體需求 | |
|---|---|
| 樣品型態 | Total RNA (DNase Treat & Dissolved in Nuclease-free Water) |
| 總量 | ≧ 750 ng |
| 濃度 (Qubit) | ≧ 50 ng/ul |
| 體積 | ≧ 15 ul |
| RNA 品質 | Bioanalyzer RIN ≧ 7 (ideally > 8) |
定序策略
- PacBio Revio Platform
- For transcriptome isoforms :
4~8-plex Transcriptome → One SMRT Cell 8M - For fusion gene :
One Human Transcriptome → One SMRT Cell 8M
分析流程及內容
- 互動式介面 E-Report，並導入基因組視化工具 Integrative Genomics Viewer (IGV)，清楚呈現每一 Transcript 的外顯子位置及其組合。
- 偵測及分析各種 Isoform 種類與數量。
- 針對有差異的 Transcript 之對應基因，依據資料庫 (如 GO、KEGG) 進行差異表現基因富集分析。
- 視覺化呈現各融合基因 (Fusion gene) 所包含的基因及連接的斷點。
- 針對二重複以上實驗，提供組間同一基因不同 isoform 之表現轉換分析 (isoform switch analysis)。
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