16S rDNA 是細菌中的一種保守基因,長度約為 1500nt,DNA 序列包含 V1~V9 高度變異的區域,即使在相近的物種之間也有差異的特性,使得 16S 區域的序列分析在細菌分類學或鑑定中被廣泛使用。我們利用 PCR 引子擴增全長 16S rDNA,然後透過 PacBio HiFi 長讀長的定序技術,提供高精確性的定序結果,達到 "物種" 級別分類和鑑定。
自樣品萃取之細菌 DNA,利用 1-Step PCR 擴增全長 16S rDNA (V1-V9) 區域的片段,同時於 5‘ 端連接特定的 Barcode 序列。隨後,將雙股 PCR 產物接上 PacBio 特殊設計的髮夾彎序列,製備成啞鈴狀模板 (SMRTbell) 文庫,並於 PacBio Sequel IIe 平台進行定序。
DNA QC 標準: | ||
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樣品種類 | 純菌 DNA | 含 host DNA |
總量 (Qubit, dsDNA) | ≥150 ng | ≥300 ng |
體積 | ≥15 µL | ≥15 µL |
濃度 | ≥10 ng/uL | ≥20 ng/uL |
品質 (TapeStation) | major peak ≥ 10kb | major peak ≥ 10kb |
PacBio SMRTLink 被用於校正定序下機的原始數據並生成 CSS reads。Q 值達到 Q20 的 CCS reads 被定義為 HiFi reads。樣品拆分後,我們去除了序列中的樣品標籤和非生物鹼基的接合子 (adapter)。接著,我們根據序列的錯誤率和長度篩選掉低品質序列,並將保留之序列它們校正為一致的方向,然後運行 DADA2 演算法降噪,以獲得 ASVs (Amplicon Sequence Variants) 的特徵序列。
我們使用了三個資料庫,包括 NCBI 16S ribosomal RNA sequences (BioProject 33175 和 33317 的 RefSeq 記錄),Genome Taxonomy Database (GTDB) 和 SILVA database20,並使用 Naive Bayesian Classifier 對這些 ASVs 進行物種註釋。此外,我們還利用親緣關係樹估算組內 (alpha) 和組間 (beta) 的多樣性,結合不同統計模型的結果和互動式圖表,生成網頁報告。
Rarefaction curve
Observed features 和 Shannon's index 之運算結果
α diversity
7 種多樣性指數計算
β diversity
6 種多樣性指數計算
Representative sequence and taxonomy assignment per ASV
每個 ASV 的總量和對應之物種註釋,點選序列即可進行線上 BLAST。
Taxonomy abundance table
提供絕對豐度和相對豐度之結果表格
Barplot of taxonomic classification
互動式介面調整樣品排序和整體配色
Krona Interactive Pie Chart
以圓餅圖顯示樣品之物種組成
Heat Tree Plot
查看各分類階層之物種組成
Sankey plot
展示樣品菌種在各分類階層之變化
ANCOM-BC
(Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction)
駢對檢定,分析結果以火山圖顯示差異菌種,可以互動式介面調整參數。
LEfSe (Linear discriminant analysis Effect Size)
進行多組比較,分析結果以直條圖和分支圖呈現。
Hierarchical Clustering Heatmap with Dendrograms
以物種之豐度進行樣品聚類熱圖繪製
Heatmap
顯示多組比較結果
Forest plot
顯示駢對比較結果