16S full length rDNA Sequencing
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16S full length rDNA Sequencing 16S full length rDNA Sequencing

16S rDNA 是細菌中的一種保守基因,長度約為 1500nt,DNA 序列包含 V1~V9 高度變異的區域,即使在相近的物種之間也有差異的特性,使得 16S 區域的序列分析在細菌分類學或鑑定中被廣泛使用。我們利用 PCR 引子擴增全長 16S rDNA,然後透過 PacBio HiFi 長讀長的定序技術,提供高精確性的定序結果,達到 "物種" 級別分類和鑑定。

擴增全長 16S rDNA,透過 PacBio HiFi 長讀長的定序技術,達到物種級別分類和鑑定。

自樣品萃取之細菌 DNA,利用 1-Step PCR 擴增全長 16S rDNA (V1-V9) 區域的片段,同時於 5‘ 端連接特定的 Barcode 序列。隨後,將雙股 PCR 產物接上 PacBio 特殊設計的髮夾彎序列,製備成啞鈴狀模板 (SMRTbell) 文庫,並於 PacBio Sequel IIe 平台進行定序。

萃取細菌 DNA,製備 SMRTbell 文庫,並於 PacBio 平台進行定序。

檢體需求

DNA QC 標準:
樣品種類 純菌 DNA 含 host DNA
總量 (Qubit, dsDNA) ≥150 ng ≥300 ng
體積 ≥15 µL ≥15 µL
濃度 ≥10 ng/uL ≥20 ng/uL
品質 (TapeStation) major peak ≥ 10kb major peak ≥ 10kb

定序策略

  1. PacBio Sequel IIe Platform
  2. 每樣品 10,000 HiFi Reads

分析流程

PacBio SMRTLink 被用於校正定序下機的原始數據並生成 CSS reads。Q 值達到 Q20 的 CCS reads 被定義為 HiFi reads。樣品拆分後,我們去除了序列中的樣品標籤和非生物鹼基的接合子 (adapter)。接著,我們根據序列的錯誤率和長度篩選掉低品質序列,並將保留之序列它們校正為一致的方向,然後運行 DADA2 演算法降噪,以獲得 ASVs (Amplicon Sequence Variants) 的特徵序列。

我們使用了三個資料庫,包括 NCBI 16S ribosomal RNA sequences (BioProject 33175 和 33317 的 RefSeq 記錄),Genome Taxonomy Database (GTDB) 和 SILVA database20,並使用 Naive Bayesian Classifier 對這些 ASVs 進行物種註釋。此外,我們還利用親緣關係樹估算組內 (alpha) 和組間 (beta) 的多樣性,結合不同統計模型的結果和互動式圖表,生成網頁報告。


16S 全長標準分析 - Diversity analysis

  • 分析結果為向量檔案格式,不失真且容易編輯。
  • 提供敘述性統計和整體與胼對檢定結果,透過互動式表格可快速篩選出符合條件之結果。

Rarefaction curve
Observed features 和 Shannon's index 之運算結果

Observed features 和 Shannon's index 之運算結果

α diversity
7 種多樣性指數計算

α 多樣性指數計算結果

β diversity
6 種多樣性指數計算

β 多樣性指數計算結果

16S 全長標準分析- Taxonomic assignment

  • 提供 ASV 之物種註釋結果,和樣品豐度資訊。
  • 以各式互動圖表分析樣品物種組成。

Representative sequence and taxonomy assignment per ASV
每個 ASV 的總量和對應之物種註釋,點選序列即可進行線上 BLAST。

每個 ASV 的總量和對應之物種註釋範例。

Taxonomy abundance table
提供絕對豐度和相對豐度之結果表格

提供絕對豐度和相對豐度之結果表格

Barplot of taxonomic classification
互動式介面調整樣品排序和整體配色

以長條圖呈現分類學的結果

16S 全長標準分析 - 物種組成

  • 提供 ASV 之物種註釋結果,和樣品豐度資訊。
  • 以各式互動圖表分析樣品物種組成。

Krona Interactive Pie Chart
以圓餅圖顯示樣品之物種組成

Krona 互動式圓餅圖展示樣品之物種組成

Heat Tree Plot
查看各分類階層之物種組成

物種階層熱樹圖以節點、枝條以及顏色來標示各分類階層之豐度

Sankey plot
展示樣品菌種在各分類階層之變化

菌種在各分類階層之變化

16S 全長標準分析 - 群組分析

Differential abundance analysis
  • 對不同組別差異性顯著影響之物種。

ANCOM-BC
(Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction)

駢對檢定,分析結果以火山圖顯示差異菌種,可以互動式介面調整參數。

以火山圖顯示差異菌種分析結果

LEfSe (Linear discriminant analysis Effect Size)
進行多組比較,分析結果以直條圖和分支圖呈現。

群組分析以直條圖和分支圖呈現多組比較結果。

Hierarchical Clustering Heatmap with Dendrograms
以物種之豐度進行樣品聚類熱圖繪製

以物種之豐度進行樣品聚類熱圖繪製

16S 全長標準分析 - 細菌功能性預測分析

Functional analysis
  • 以 PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Observed States) 進行功能性預測。
  • 使用 MetaCyC 和 KEGG 資料庫。
  • 提供敘述性統計和整體與胼對檢定結果,透過互動式表格可快速篩選出符合條件之結果。

Heatmap
顯示多組比較結果

細菌功能性預測分析

Forest plot
顯示駢對比較結果

細菌功能性預測分析
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