常見問題 - 威健股份有限公司

常見問題 FAQ

LCM 細胞擷取服務：

1.	Q.	冷凍組織切片的厚度大約要多少，才能在 LCM 系統中被擷取？
	A.	7~8 μm。
2.	Q.	已切好的組織切片 Slide 該如何保存才可確保 RNA 沒有被分解掉，以及能讓組織容易被 LCM 擷取？
	A.	–80 ℃ 保存。
3.	Q.	組織切片在染色、脫水後進行 LCM 操作，其操作時間的安全範圍(即 RNA 不被分解的安全範圍)？
	A.	盡量在一小時之內結束，但 1~2 小時都屬安全範圍。
4.	Q.	LCM 後的 RNA 的品質為何可進行後續晶片實驗？
	A.	RNA 品質應達到以 NanoDrop OD 260/280 ratio 為 1.8~2.1 及 Bioanalyzer 2100 (RIN > 6) 作 RNA 完整度標準，如果沒有的話可再確定下列幾點： 1. 全程是否 RNase-free 操作 2. 新鮮的檢體在取下後如無法馬上進行 OCT 包埋，也應在 15 分鐘內將其保存在 -40 ℃ 以下的低溫環境中 3. LCM 操作時間在 1~2 hrs 內
5.	Q.	LCM 要擷取多少細胞才能進行後續晶片實驗？
	A.	依照細胞 RNA quality 決定，約需 2000 ~ 10000 cells。
6.	Q.	需要準備多少 slides？
	A.	主要還是依照標的細胞的 quality 及所擷取的細胞數目準備 10~20 片。

高通量 Q-PCR 服務：

1.	Q.	送樣後多久可以拿到報告?
	A.	如從樣品抽取核酸開始，並包含引子設計，報告可以在送樣後約四個禮拜內收到；報告取得時間會因樣品數的多寡及樣品 QC 後的回覆時間快慢而有所增減。
2.	Q.	自備的引子或是引子序列可以進行 QPCR 實驗?
	A.	如客戶有自備的引子或是引子序列，威健會先幫您進行引子測試，以確認引子是否適合於進行 QPCR 實驗。
3.	Q.	委託威健進行 QPCR 所設計的引子序列最後會給客戶嗎?
	A.	委託威健設計的引子序列最後會在報告中列出。
4.	Q.	委託威健所設計的引子在進行 QPCR 實驗後是否可以取回?
	A.	您當然可以取回引子；您可以先通知當區的威健業務同仁說要取回引子，之後便會寄回給客戶。
5.	Q.	是否可以進行絕對定量的 QPCR 實驗?
	A.	只要能提供足量的標準品 (已知 copy number 與濃度)給威建，便可為您安排實驗。

SNPs QPCR 服務：

1.	Q.	溶於 TE buffer 的 DNA sample 是否可進行實驗？
	A.	原則希望客戶的 sample DNA 皆溶於水中，因 OpeAarray 是在 88 nl 的小體積下進行 PCR，若有 EDTA 存在下可能會干擾 PCR 而影響分型的結果，如果客戶僅有 TE buffer 的 DNA sample，仍會初步以 QPCR ATP2B4 gene 先行 QC 判斷是否可行，但最後的 SNP 分型的準確度可能較低。
2.	Q.	約有多少比例的 SNP 可被判出
	A.	約有 95% 可被判斷分型。
3.	Q.	可否臨時追加樣品進行分析
	A.	因 OpenArray plate 有最小訂購單位，每次採購都有相對的 sample 數量，所以無法接受臨時追加樣品。
4.	Q.	多久可拿到報告
	A.	ABI 的 OpenArray plate 到貨後約需兩星期時間即可完成分析報告。

基因晶片服務：

核酸萃取

威健有 RNA, DNA, miRNA Isolation 的服務嗎?

有，但都必需接續主要分析實驗服務，包含 Microarray、QPCR、NGS 等服務。

該如何準備 sample ?

請參考 DNA 檢體收集建議流程及 RNA 檢體收集建議流程。

如何將 sample 交給威健?

您可以電話通知威健業務，針對您的檢體狀況討論送件方式。客戶若已準備好 sample，我們會有專人前去收檢。

一般進行 RNA QC 方法有哪些﹖

一般 RNA QC 方法有下列兩種方法：

a.	OD260/280 比例，一個純度高的 RNA 樣品比值應落在 1.9-2.1 之間。
b.	若樣品為 total RNA ，則可以採 1% denaturing agarose gel 電泳分析 28S rRNA 及 18S rRNA 的長度分布(如下圖)，其中 28S rRNA 的位置相當於 ~4.5 kb，18S rRNA 的位置相當於 ~1.9 kb。而除了 28S 及 18S rRNA 有清楚的 band 之外，膠體的電泳其他區域應沒有其他肉眼可見的 rRNA 片段分布。

威健 RNA QC 的方法﹖

目前威健採用 Agilent 2100 Bioanalyzer 分析 total RNA 樣品，其原理是利用毛細管電泳來分離 RNA，此方法的靈敏度及準確度皆較 OD260/280 比例及 agarose 膠體電泳為佳。

RIN 值的意義為何？

RNA integrity number (RIN) 為 RNA 完整度指標是由 Agilent Bioanalyzer 2100 軟體根據多項參數所計算出的數值，用以判斷 total RNA 的完整度，RIN 值由 0~10，數值越高表示 total RNA 的完整度越好，反之數值越低表示 RNA degrade 情形越嚴重。

CGH Microarrary

1.	Q.	對照組用什麼比較好？
	A.	對照組需要依照實驗目的與設計選用，選擇建議請參考樣品條件說明。另外，一組實驗建議採用單一正常個體，而非多數正常個體等量混合為對照，因為等量混合容易因各對照組 DNA 製備差異造成的變異雜訊及個體間變異位置差異，而造成該處 copy number 無法正確判定。
2.	Q.	我提供的 DNA 很多，為什麼威健定量後很少？
	A.	有這種狀況可能是因為 1. 客戶定量儀器的誤差：威健使用 NanoDrop 定量，並以 Bioanalyzer 2100 做 QC 並 double confirm，此二種儀器皆有定期校正，誤差機率極低。建議客戶端再行儀器校驗，或使用多種工具 confirm。2. aCGH 實驗需去除 RNA，如客戶未加 RNase 去除 RNA，定量結果就會有誤差，若有此種狀況，威健可代為 clean-up，但之後定量結果必然較低。
3.	Q.	aCGH 結果要怎麼分析比較好？一樣是篩選兩倍差異的點嗎？
	A.	aCGH 結果分析非常依賴圖形化工具，一般會將各個偵測點排列在 chromosome physical location 上，以便查知是否為連續段落變異。威健出具的報告，己利用圖形化工具顯示變異位置，但變異位置過多時無法完全展示，若有此種狀況可參考 cytoreport 以得知變異位置分布情況。

ChIP-on-chip Microarrary

1.	Q.	前面免疫沉澱的步驟頗為困難，可否代為操作?
	A.	免疫沉澱的步驟非常關鍵，且因各客戶所用抗體等條件各異，難以規格化，由原委託之實驗自行控制為宜。
2.	Q.	樣品量很少很難 QC，怎麼辦才好？
	A.	樣品量太少可先用 WGA kit 放大，如果放大效果依舊不理想(對照於平行操作之 input 樣品)，即表示此樣品太少或不佳，則需考慮重做與否。建議在進行 clean-up 步驟時採用 column based kit 而非沉澱法，雖然檢體會 loss 但可避免雜質的干擾，以利後續實驗準確度。

Gene Expression Microarray

1.	Q.	Gene Expression 分析實驗需要多少時間?
	A.	一般而言，Gene Expression 分析實驗約需 3 周時間。但詳細狀況依樣品量以及分析方式而有所不同，請與威健業務聯繫確認。
2.	Q.	如樣品 RNA 總量不足 5 µg 還可以進行實驗嗎?
	A.	如樣品 RNA 28S/18S ratio 及 RIN (RNA Integrity Number) 達到 QC 標準，可與實驗室討論評估是否能進行後續實驗。
3.	Q.	雙光實驗和單光實驗可以彼此相互分析嗎?
	A.	由於實驗模式不同，所以這兩種實驗結果無法相互比較。
4.	Q.	為甚麼要先進行 RNA QC？
	A.	因為 microarray 結果的準確度和RNA的品質有相當大的關係，若 RNA 品質不佳，則結果的可信度則存疑。因此威健對 sample 都會進行 QC，確保實驗的準確度。

Methylation Microarray

1.	Q.	解析度如何?
	A.	Agilent 目錄晶片是以 CpG island 位置向左右各延伸 95 bp 範圍區間內進行設計，每個探針平均約間隔 100 bp。其偵測用探針數量約有，平均每 Island 約有 7 個探針偵測，此即其解析度。
2.	Q.	DNA 需求量是否可以降低？
	A.	由於甲基化 DNA 一般比例不高，且又需以抗體做免疫沉澱，能得到的甲基化 DNA 不多，所以才要求 DNA 總量大於 10 ug 。其他因程序考量而要求增加的部分，可依照客戶檢體總量調整。但為免耽誤實驗進展，請盡量提供足量 DNA。
3.	Q.	後續之資料分析如何進行比較好？
	A.	Methylation Microarray 資料分析目前仍無普遍標準，目前威健使用 Agilent Genomic Workbench 進行資料分析，發表 paper 時較有依據，不易引發爭議。另外，建議您在所偵測出的位點，挑選局部具代表性或預定於 paper 中述及者，進行 bisulfite sequencing 驗證。此外，可以使用 Agilent Genomic Workbench 以整體 genome view 的觀點檢視 chromosome 的分佈是否呈現 cluster 現象。
4.	Q.	偽陽性率與偽陰性率如何？
	A.	Microarray 實驗本身極少偽陽或偽陰性結果，但由於此實驗前半段為抗體免疫沉澱，實驗正確性與抗體特異性相關，因此，Methylation Microarray 可能有偽陽或偽陰性結果，而目前此比率尚無實際數據。因此，威健建議在判定 methylation 之資料時，採用連續的 3 個 probe 皆有顯著差異者，才認定為 methylation 位點。

microRNA Microarray

1.	Q.	如何計價？
	A.	由於威健所提供的 miRNA 分析服務具有相當程度的客製化，我們必須依照客戶所提供的樣品形式、數量、實驗設計比較等資訊為客戶量身打造最適合且合理的報價。想了解價格可來電 02-66160001 或是 e-mail：service@welgene.com.tw 將會有專人為您做說明。
2.	Q.	microRNA Microarray 分析實驗約需多久？
	A.	一般而言，microRNA Microarray 分析實驗約需 5 周時間。但詳細狀況依樣品量以及分析方式而有所不同，請與威健業務聯繫確認。
3.	Q.	RNA 純化方法建議有四種，那一種最好？
	A.	一般來說 TRIZOL Reagent 純化方式是最經濟且方便，也是目前應用最多的方法。不管何種純化方式都不會影響結果的準確性與再現性，但為了實驗品質的可靠與一致，建議客戶凡是在同一實驗設計比較之樣品，一律採用相同方式進行RNA 純化。
4.	Q.	客戶可以的到什麼樣的分析結果？
	A.	威健會根據樣品的數量以及實驗設計為客戶進行分析比較，同時篩選出有意義或是顯著變化的 miRNA 以供客戶做參考。

Custom Microarray

1.	Q.	客制化晶片設計需時多久，我可以拿到晶片：
	A.	一般探針設計需時 1-2 周，晶片確認訂出後約 3~4 周，即可收到晶片。
2.	Q.	如何確認 Agilent 目前的制式晶片種類 (catalog microarray)？
	A.	Agilent 目前除了提供人類、大鼠、小鼠的全基因組基片外，另也提供一系列的模式物種 Microarray (最新資訊，請連結 gene expression，ChIp-on-chip， aCGH)，如果研究人員在上述資訊中無法尋得欲分析物種之晶片，則請洽客服、或當區的服務工程師，確認進行客製化晶片的設計。
3.	Q.	我最近經由 Next Generation Sequencing，得到一物種的 transcriptome 序列，請問如何利用這些資訊來設計該物種的客製化晶片?
	A.	只要您將序列及註解資訊整理成 FASTA 格式，提供給我們即可。
4.	Q.	我的實驗組數不多，請問可以只訂一片晶片嗎?
	A.	Agilent 的靈活噴墨晶片製程 (SurePrint platform)，可自由製造您專屬的研究用晶片，一片也可以幫您客制合成，且不需額外的探針設計費。