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LCM 雷射微組織細胞擷取服務 |
由於臨床檢體常為多種的型態細胞或組織所構成，因此這類型的樣品進行基因表現研究所得的結果即為這些細胞或組織之基因表現之總和，而非特定的組織的基因表現。因此，針對特定組織或細胞的研究，如癌細胞的基因研究等，威健提供雷射微組織細胞擷取技術
( laser capture microdissection，簡稱
LCM )，以加速這方面的研究。
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雷射微擷取處理圖 (圖一) |
視野下所觀察到之組織切片
1.
雷射微擷取處理前之組織
型態。 |
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2.
雷射微擷取處理後之組織
型態。
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3.
雷射微擷取到
之標的細胞。 |
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雷射擷取微組織技術
(圖二)
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自1996年起，美國NIH發展出雷射擷取微組織技術，它是將臘質蓋子置於組織上，經顯微鏡觀察並選取欲擷取的細胞或組織，再利用進紅外光雷射針對欲擷取的區域融化蓋子表面的臘質，使融化的臘質得以沾取欲擷取的細胞或組織，最後取出沾有細胞的蓋子，即可進行接下來的
RNA 純化。(圖二)
本公司在雷射擷取微組織技術的應用上，已能擷取單一細胞（圖一,3 ）， 並將 800-2,000 |
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個細胞 RNA 由組織中純化出來並線性放大至大於 50ug 以上。同時成功地進行微陣列之基因表現分析。 |
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目前我們是以 PixCell II® system 提供 Laser capture microduseection 服務，服務種類有： |
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1. |
LCM 細胞擷取：客戶若需純化細胞的 RNA 者，請提供冷凍切片，若需純化細胞的 DNA 者，蠟塊包埋切片即可。 |
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2. |
LCM 細胞擷取連結微量 DNA 純化：客戶請提供蠟塊包埋切片，切片厚度為 7~ 8 m m 。 |
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雷射擷取細胞儀 PixCell II (圖三) |
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3. |
LCM 細胞擷取連結微量 RNA 純化：客戶請提供冷凍切片，樣品準備建議事項， 請見 LCM
樣品處理建議流程 ， 服務的流程為如下圖， 請儘量湊足 1000 個標的細胞量之連續 冷凍 切片，我們會選擇第一片或最後一片，刮取波片上的組織，進行
RNA 純化，以 Agilent Bioanalyzer 2100 搭配敏感度為 500pg 的 Agilent
RNA 6000 Pico ，確認 RNA 完整度，若 RNA 完整度 QC 通過，會再與顧客確定細胞擷取條件，進行細胞擷取，擷取、
RNA 純化後會檢附 RNA
QC 資訊 ，及擷取細胞影像 ( 如圖一 ) 。 |
雷射擷取細胞連結 RNA 純化流程圖 (圖四) |
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經由 LCM 擷取細胞純化得之 RNA 量多在身 pg~ng ，若要進行多個基因的 RT-PCR 實驗，或 microarray 實驗， RNA 量尚有不足，因此我們也提供 RNA 線性放大服務，原理為 T7-based linear RNA amplification ，其流程如左圖：
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1. |
first stranded cDNA 的合成： RNA 放大的標的為 mRNA ，首先以 5' 端具 T7 啟動子序 |
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線性 RNA 放大流程 (圖五) |
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列的 oligo-dT 為引子，藉 MMLV RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ) 進行 cDNA 合成。 |
| 2. |
雙股 cDNA 合成：藉由 MMLV RT 的 RNaseH 活性會水解 mRNA ，產生RNA 引子供第二股的 cDNA 合成，如此合成的雙股 cDNA ， 5' 端皆具 T7 啟動子 。 |
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3. |
in vitro transcription 反應：經由加入 T7 RNA polymerase 及 dNTP ， T7 RNA polymerase 即會認知 T7 啟動子序列，以這些 T7-cDNA 為模板，合成大量的 RNA ，由於這反應為線性反應，因此稱為 RNA 線性放大反應。 |
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4. |
cRNA 放大後，未確認反應是否成功，我們會以 spectrophotometry 測定 cRNA 產量，藉此計算 RNA 放大效率，一般而言，放大倍率可達 400 倍以上；另外以 Agilent bioanalyzer 2100 測定 cRNA 長度分布，通常因 reverese transcriptase 效率的問題， cRNA 會較原來的 mRNA 長度短，多分布於 200~1000 nt ( 如右圖 ) 。 |
| cRNA QC ( 圖六 ) |
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